林红  傅宝玉  王炳元  傅炜昕  李异玲  崔巍

    【关键词】  肝疾病，酒精性； 胶原； 肝星状细胞；  抗纤复方Ⅰ号
Invention of Kangxian Fufang I on the proliferation and  collagen synthesis in cultured hepatic stellate cells stimulated by acetaldehyde. LIN Hong, FU Bao-yu, WANG Bing-yuan, FU Wei-xin, LI Yi-ling, CUI Wei.

    【Key words】    Alcoholic liver diseases;  Collagen;  Hepatic stellate cell;  Kangxian Fufang I

    【First author''s address】     Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China

　　观察了中药抗纤复方Ⅰ号（KXⅠ）对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)增殖、胶原合成的影响，以期阐述KXⅠ抗酒精性肝纤维化的部分作用机制。

    一、材料与方法

    1. 药物与药物血清的制备：KXI（主要由丹参、黄芪、红花等十味药物组成）浓缩口服制剂，每ml含生药2.7g。按11ml/kg给Wistar大鼠灌服中药制剂，每天1次，持续给药1周，末次给药后1h无菌条件下由下腔静脉取血，取血清56℃灭活30min，分装-20℃冻存。另选正常大鼠喂以等量等渗盐水，以同样方法制备正常血清作对照用。

    2. HSC分离、培养及鉴定：参照宋少刚等[1]报道大鼠肝脏原位灌流消化的方法分离HSC。细胞得率约为1×107/肝，经台盼蓝染色细胞存活率90%以上。将细胞爬片用兔抗人Desmin抗体、SP法作免疫细胞化学染色以鉴定HSC，胞浆阳染者为HSC，传代的HSC纯度>98%。本次实验采用传2-4代HSC。

    3. 细胞增殖率测定：采用MTT比色法[2]，传代的细胞长满单层后分成正常血清对照组、正常血清+乙醛组及药物血清+乙醛组（乙醛为国产分析纯）。药物组用药物血清加入无血清DMEM培养液中，制成浓度为10%的药物血清孵育液，加入乙醛使之终浓度分别为100、200、300μmol/L，培养24h。正常血清+乙醛组以同样方法添加正常血清及乙醛。用酶标仪（E-Liza Mat-300）测其A值。

    4. 放射免疫法测定Ⅲ型前胶原（PCⅢ）含量：HSC按方法3分为3组。正常血清及药物血清孵育液浓度均为10%（配法同3），乙醛组加入乙醛后使终浓度为100μmol/L，培养24h后收集培养上清液，严格按试剂盒说明操作（PCⅢ放射免疫测定试剂盒购于上海海军医学研究所）。JC-1200放射免疫γ计数仪上直接测定PCⅢ含量（μg/L），取均值。

    5. HSCα1（I）型胶原mRNA测定（RT-PCR试剂盒购于大连宝生物工程有限公司）：HSC按4方法处理后，提取6h和24h的总RNA并逆转录成cDNA。α1（I）型胶原引物序列：正义5′-CCG TGG TGA CAA GGG TGA GACAG-3′，反义 5′-TCA GGG CTG CGG ATG TTC TCA-3′（扩增产物471bp）；β-actin引物序列：正义 5′-GAT TGC CTC AGG ACA TTT CTG-3′，反义 5′-GAT TGC TCA GGA CAT TTC TG-3′（扩增产物690bp）。引物均由北京奥科公司合成。总体积25μl，首先94℃ 3min变性，以后94℃ 40s→62℃ 1min→72℃ 1min，共35个循环，72℃ 7min终止反应。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳、摄片、密度扫描，然后用其表达量与对应的β-actin表达量进行比较。

    6. 统计方法：两两均数的比较用t检验。

    二、结果

    1.  实验中不同浓度的乙醛及药物血清对HSC形态和生长无影响。

    2.  乙醛及药物血清对HSC增殖的影响见表1。

表1  乙醛和药物血清对肝星状细胞增殖的影响
（x-±s，A值）
组别  　　　　　样本数  　　　　　　　HSC增殖
正常血清组 　　　 15                                 0.14±0.03
正常血清+乙醛组 　15
 　　　　　　100μmol/L组  　                    0.18±0.02*
                         200μmol/L组                          0.17±0.01*
                         300μmol/L组                          0.17±0.02*
药物血清+乙醛组 15
                          100μmol/L组                         0.14±0.00**
                          200μmol/L组                         0.18±0.01
                          300μmol/L组                         0.18±0.01
  * 与对照组比，t值分别为3.95、4.23、3.85，P<0.05；** 与正常血清+乙醛组比，t＝4.57，P<0.05

    3.  乙醛及药物血清对HSC分泌的PCⅢ的影响：正常血清对照组PCⅢ分泌量为（56.38±12.86）μg/L，正常血清+乙醛组为（90.94±22.84）μg/L（与对照组比t＝4.72，P<0.05），药物血清+乙醛组为（35.03±13.86）μg/L（与正常血清+乙醛组比 t＝12.31，P<0.01）。

    4. 乙醛及药物血清对HSCα1（I）型胶原mRNA表达的影响：RT-PCR结果显示，乙醛浓度为100μmol/L时，6h刺激HSC α1（I）型胶原mRNA表达显著增加，至24h仍有较强的信号，10%药物血清能明显抑制α1（I）型胶原mRNA表达。

    三、讨论
　　
    肝纤维化的发展是细胞外基质合成增加、降解减少的结果。HSC的活化是肝纤维化发生的中心环节，是分泌合成胶原的主要细胞[3]。在酒精性肝病发病机制中除乙醇的直接肝毒性，乙醇在肝细胞内代谢产生的毒性代谢产物乙醛及引起的代谢紊乱是导致酒精性肝损伤的主要原因[4]。用乙醛直接刺激体外传代培养的HSC，尽管细胞生长良好，形态无改变，但能明显刺激HSC增殖，PCⅢ分泌增加，α1（I）型胶原mRNA表达显著增高等，可能主要是通过下调HSC间质胶原酶-1基因表达，增加I型胶原mRNA表达，促进细胞外基质的积聚，导致肝纤维化的发生（结果待发表）。目前抗肝纤维化治疗中针对HSC的治疗主要集中于抑制HSC激活、增殖及胶原合成，促进胶原降解。中药KXI主要由活血化瘀类药物组成，10%药物血清能明显抑制乙醛引起的HSC增殖、PCⅢ的分泌及α1（I）型胶原mRNA表达，可能是其防治酒精性肝纤维化的作用机制之一。

    参  考  文  献

    1宋少刚, 杨雁, 陈敏珠. 大鼠肝贮脂细胞、枯否细胞的同时分离和培养. 中国临床药理学与治疗学, 2000, 5: 351-353.

    2陆伦根, 曾民德, 李继强, 等. 甘油三酯和极低密度脂蛋白对肝星状细胞增殖的影响. 中华肝脏病杂志, 1998，6: 241-242.

    3Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem, 2000, 275: 2247-2250.

    4Li CJ, Nanji AA, Siakotos AN, et al. Acetaldehyde-modified and 4-hydroxynonenal-modified proteins in the livers of rats with alcoholic liver disease. Hepatology, 1997, 26: 650-657.

    作者单位：110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院消化内科（林红、傅宝玉、王炳元、李异玲、崔巍）；沈阳军区总医院检验科（傅炜昕）