傅遍红  吴泽志  张海雁  秦建  蔡绍皙  吴云鹏  董澄

    【摘要】  目的  研究整合素β1亚单位对肝癌细胞与层黏连蛋白（LN）趋化行为的影响。 方法  采用双微吸管实验法进行肝细胞癌（HCC）细胞趋化实验，在两侧微管内加入相同浓度(50μg/ml，200μg/ml)的LN，并引导微管尖端与同一HCC细胞紧密接触，动态观察细胞两侧伪足形成过程；当两侧微管LN浓度为200μg/ml，在一侧微吸管内加入针对整合素β1亚单位（CD29）的单克隆抗体（Anti-CD29）20μg/ml，考察β1整合素亚单位阻断对HCC细胞伪足形成的影响。利用流式细胞仪对HCC细胞表面整合素β1亚单位的表达进行分析。 结果  两侧微吸管加入相同浓度的LN，细胞向两侧微吸管两侧均有伪足形成；随作微吸管内LN浓度的增加，细胞伪足增加，且两侧微吸管内伪足的变化基本呈对称性；在此基础上，微吸管加入Anti-CD29的一侧，HCC细胞伪足生长曲线呈现明显的抑制，而未加入Anti-CD29的微吸管一侧与加入的对侧相比，该侧细胞的伪足明显增加。流式细胞仪分析表明，所研究细胞整合素β1亚单位表达率达95.78%。 结论  整合素β1亚单位是联系HCC细胞与HCC细胞对LN趋化性伪足形成的重要受体基础。

    【关键词】  癌, 肝细胞; 结合素类; 层黏连蛋白; 趋化性；  

　　Integrin beta1 mediates hepatocellular carcinoma cells chemotaxis to laminin  FU Bian-hong*, WU Ze-zhi, ZHANG Hai-yan, QIN Jian, CAI Shao-xi, WU Yun-peng, DONG Cheng. *Key Lab for Biomechanics and Tissue Engineering under the State Ministry of Education, College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China

    【Abstract】    Objectives    To study the effects of integrin beta1 on the chemotaxis of hepatocellular carcinoma (HCC) cells to laminin (LN). Methods    A micropipette technique was adopted to investigate the effect of integrin beta1 blockade on pseudopod protrusion of HCC cells in response to LN stimulation. Chemotactic pseudopod protrusion of a HCC cell was evaluated using a dual-pipette set-up, in which two pipettes filled with LN solution were positional in close contact with the same cell, and pseudopod protrusion into each pipette was viewed dynamically and recorded with a tape recorder. The lengths of pseudopods were measured, then plotted against time to obtain a pseudopod growth curve. The integrin beta1 subunit on the surfaces of HCC cells was analyzed by flow cytometry. Results    In dual pipette chemotaxis experiment, when the two pipettes were filled with LN (50μg/ml, 200μg/ml), pseudopods extended from the HCC cells into each of the pipettes nearly symmetrically. Upon addition of anti-CD29 (20μg/ml) to one of the pipettes, the pseudopod protrusion was blocked almost completely, while the pseudopod protrusion into the opposite pipette became more evidently, with larger maximum length. The expression rate of integrin beta1 on the cells was up to 95.78%. Conclusion    Integrin beta1 subunit is the important receptor for mediating HCC cells chemotaxis to laminin.

    【Key words】    Carcinoma, hepatocellular;  Integrins;  Laminin;  Chemotaxis 

    癌细胞的侵袭涉及细胞与细胞外基质（extra-cellular matrix, ECM）复杂的相互作用，按照Liotta等[1]的观点，这一相互作用包括如下三个步骤，即第一步肿瘤细胞与细胞外基质发生黏附。第二步是肿瘤细胞本身或诱导宿主细胞分泌蛋白水解酶降解基质。最后一步即趋化（chemataxis）或趋触（haptotaxis）介导的细胞运动。整合素是连接细胞与ECM相互作用最重要的受体。为了解β1家族整合素受体在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞对层黏连蛋白（laminin，LN）趋化作用中的影响，采用独特的双微吸管实验技术，进一步针对整合素β1亚单位（CD29）的单克隆抗体（Anti-CD29）研究抗体阻断对HCC细胞趋化行为的影响。在双侧微管内加入相同浓度的LN趋化剂，观察HCC细胞两侧伪足形成的动态过程。进一步于一侧微吸管加入Anti-CD29，观察抗体阻断HCC细胞对LN趋化伪足形成的影响。

    材料与方法

    一、主要材料
　　
    LN（美国Sigma公司）储备液浓度1g/L。RPMI 1640配成所需要浓度，用作趋化剂，-20℃保存；RPMI 1640培养液（美国Hyclone公司），pH 7.4，0.1μm滤膜过滤除菌；多聚赖氨酸（poly-D-lysine，PDL）（美国Sigma公司），以蒸馏水稀释至2μg/ml后分装备用；牛血清白蛋白（华美公司），以等渗磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配成0.5%的溶液备用；HCC细胞：选用SMMC-7721细胞株，购于第二军医大学；Anti-CD29（美国Sigma公司）属鼠IgG抗体，IgG浓度300μg/ml，4℃保存；FITC标记兔抗鼠二抗（美国Sigma公司），商品号F-4143，属IgG抗体，4℃保存。

    二、主要方法
　　
    1. 细胞样本的制备：HCC细胞在RPMI 1640培养液常规培养，加入10%小牛血清和青链双抗。然后在37℃，5% CO2培养箱培养,至细胞贴壁生长。用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化细胞，显微镜下观察到单个细胞悬液。RPMI 1640培养液稀释细胞悬液至悬液中大约有1×104个/ml细胞个数，以供微吸管实验用。
　　
    2. HCC细胞上CD29的表达测定[2]：将贴壁培养的HCC细胞用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化，稀释并进行细胞计数。每一样本管的细胞悬液含5×105～1×106个细胞数。一个样本管中加入5μl的Anti-CD29，4℃放置45min；阴性对照管中加入1.5μl同型匹配的非特异性免疫球蛋白，4℃放置45min；离心，用PBS洗涤3次；吸取上清液，1:100稀释FITC标记兔抗鼠二抗，并加入100μl于各样品管中，4℃放置45min；离心，用PBS洗涤3次，用流式细胞仪（美国Calibur公司）进行分析。
　　
    3. 微吸管实验系统及微吸管实验操作：微吸管实验系统如前文报道[3-6]。为了进行双微吸管操作，在原有系统上进一步配置左侧显微机械手（日本Warishige公司）[7-9]。（1）HCC细胞对LN趋化行为的研究：采用双微吸管法，将LN加入双侧微吸管中，利用显微机械手分别引导双侧微吸管靠近待观察细胞，以微负压使细胞密封管口，并使同一细胞上两个不同区域分别与两侧微管内趋化剂接触，观察并以磁带记录细胞伪足形成动态过程。经磁带回放，将电视图像输入图像处理仪（德国Kontron公司）测定伪足长度，以伪足长度对时间作图得到伪足生长曲线。（2）HCC细胞对LN的趋化行为及整合素β1亚单位阻断对趋化伪足形成的影响：首先在双侧微管，加入200μg/ml LN观察微管两侧伪足形成，以此为基础，在微管的一测加入Anti-CD29使其浓度达20μg/ml，对比观察细胞两侧伪足形成的变化。本实验选择细胞直径为12μm～17μm的细胞做测试用，微管直径大约为细胞直径的1/3。

    结    果

    一、流式细胞仪分析结果
　　
    CD29分子在HCC细胞膜上表达率为95.78%。

    二、HCC细胞对LN的趋化行为的研究
　　
    双侧微吸管左右侧的LN浓度均为50μg/ml和200μg/ml，微管内直径分别为5.42μm和5.65μm。微管两侧加入50μg/ml，200μg/ml LN趋化剂，其实验伪足生长随着时间的增加，微管两侧细胞伪足均增加，约40min后伪足开始回缩。双侧微吸管中伪足长度基本相近，生长曲线相似显示出在两侧微吸管内趋化强度相同时细胞伪足生长的对称性，见图1。                                                                          

    三、整合素β1亚单位阻断对趋化性伪足形成的影响
　　
    在上述实验基础上，在左侧微管加入Anti-CD29 使其最终浓度为20μg/ml，比较观察细胞两侧伪足的形成过程。当一侧微吸管于加入Anti-CD29后，该侧微吸管内HCC细胞伪足生长几乎完全被阻断；而不加抗体的一侧伪足最大长度较之对称性伪足的最大长度却明显增加，图2。

    讨    论
　　
    肿瘤细胞与细胞外基质发生粘附及趋化介导的细胞运动是癌细胞侵袭的主要步骤。除采用微吸管实验技术进行细胞的黏附和粘弹性研究外, 将该装置研究单个肿瘤细胞的趋化运动，扩大了其用途。人们对一些癌细胞，如恶性黑色素细胞瘤细胞，对胞外基质趋化的受体及信号机制，Aznavooria等[10]已有相当的研究，但还远未达到对趋化过程及机制的详细了解，对肝癌细胞的研究更加薄弱。在本双微吸管实验方法中，采用的研究HCC细胞趋化运动的方法与实验肿瘤学传统研究肿瘤细胞侵袭运动的方法不同，传统经典的方法是以群体细胞为观察对象（如：Boyden小室法、羊膜侵袭法、MICS法、Dunn小室法和Zigmond小室法）。这些方法可获得细胞运动的群体指标，但对细胞运动时的形态、动力学过程难以在线观测。Usami等[11]首先将微吸管技术用于研究白细胞的趋化现象；曾有研究将这一技术进一步用于Ⅳ型胶原趋化作用下黑素瘤细胞A2058伪足形成的研究[7，8]。同时，You等[9]还利用双微吸管来研究渗透压大小对黑素瘤细胞趋化形成的影响。而研究将双微吸管趋化性伪足方法进一步用于考察β1整合素亚单位对趋化性伪足形成中的作用，此趋化行为的观察，利于更好地认识HCC细胞伪足形成、生长及不同环境下伪足的变化等问题。双吸微管的对称性研究同一HCC细胞两侧对LN的趋化实验，对同一个细胞的对比是严格的。在一侧加入Anti-CD29,考察整合素β1亚单位可能对癌细胞趋化所起什么样的作用以及HCC细胞与LN的相互作用十分重要。该研究方法具有直观、精细和定量的特点。可用于研究HCC细胞趋化性伪足生长过程中相应的整合素受体对其影响。同时，采用双微管方法观察细胞的趋化效应较之与单微管法具有在同一细胞上比较不同趋化条件下的趋化效应。实验所建立的实验方法为癌转移的研究和抗癌转移药物的开发提供了在单细胞水平进行实验研究的可靠方法。
　　
    整合素[12-14]是通过传递特定的信号或诱导基因的表达来控制肿瘤细胞的存在或凋亡。整合素为α和β亚单位以非共价键连接而成的异二聚体的跨膜糖蛋白。HCC细胞侵袭与转移过程中，整合素除介导HCC细胞与HCC细胞间、HCC细胞与ECM的黏附外，它还参与了ECM的降解以及肿瘤细胞的运动（即趋触和趋化）。而β1亚单位为HCC细胞中极富代表性的整合素亚单位，流式细胞仪的分析结果表明：CD29分子在肝癌细胞株的细胞膜表面具有较强的表达。进行趋化实验时，两边微管对称性的加入相同浓度的LN作为HCC细胞趋化剂，微管两侧伪足生长均很明显，且两边伪足生长速度相似，这说明HCC细胞的伪足可对称地向趋化强度相同的方向分别生长。Anti-CD29的加入，对HCC细胞在LN中的趋化运动中对伪足具有非常明显的阻断作用，这有可能使细胞膜上整合素β1亚单位以及细胞的骨架等发生变化，从而影响细胞伪足性形成。值得注意的是，在一侧Anti-CD29的加入，另一侧伪足明显增加，这提示双侧伪足形成可能有特定的相互影响，这一相互影响可能取决于双侧伪足形成所处的环境、趋化的强度。深入探讨这一现象及其机制对本研究方法的完善具有重要意义。不管怎样，细胞伪足形成的极性或运动的方向总是向着趋化作用最强的方向，ECM的种类、浓度、抗体分子种类等均可能影响趋化运动的程度，HCC细胞伪足形成的机制还有待进一步研究。从研究结果也表明了HCC细胞有明显的β1链表达，CD29参与了LN引起的肝癌细胞伪足的形成的信号转导。
　　
    Anti-CD29对HCC细胞在LN中的趋化运动中对伪足具有非常明显的阻断作用。CD29参与了LN引起的肝癌细胞伪足形成的信号转导，整合素β1亚单位对HCC细胞趋化运动有着明显的影响。
　　
    在单细胞水平上，利用双吸微管技术研究伪足的形成和相互作用，具有直观、精细和定量的特点。实验所建立的实验方法对癌侵袭和转移的研究具有重要的方法学参考价值。

    参  考  文  献
1Liotta LA, Rao CN. Tumor invasion and the extracellular. Matrix Lab Invest, 1983, 49: 636-649.
2Cai T, Lei QY, Wang LY, et al. TGF-β1 modulated the expression of α5β1 integrin and integrin-mediated signaling in human hepatocarcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 274: 519~525.
3龙勉, 吴泽志, 王宪航, 等. 肝癌细胞粘弹性的实验研究. 生物物理学报，1996, 12: 169-173.
4俞为群, 宋关斌, 龙勉, 等. 不同细胞周期肝癌细胞的粘附特性研究. 中华肝脏病杂志, 1999, 7: 153-155.
5吴泽志, 邵开锋, 宋关斌, 等. 肝癌细胞在IV型胶原裱衬表面的粘附特性. 中华医学杂志, 1999, 79: 369-372.
6吴泽志, 罗向东, 王宪航, 等. 肝癌细胞侵袭行为与其流变学特性相关. 生物医学工程学杂志, 2000, 17: 133-138.
7Jun Y, Anndra M, Cheng D. Application of the dual micropipette technique to the measurement of tumor cell locomotion. Exp Cell Research, 1999, 248: 160-171.
8Dong C, Aznavoorian S, Liotta, LA. Two phase of pseudopod protrusion in tumor cells revealed by a micropipette. Microvasc Rec, 1994, 47: 55-67.
9You J, Aznavooria S, Liotta LA, et al. Responses of tumor cell peseudopod protrusion to changes in. medium osmolality. J Cell  Physiol, 1996, 167: 156-163.
10Aznavooria S, Stracke ML, Krutzsch H, et al.  Signal transduction for chemotaxis and haptotaxis by matrix molecules in tumor cells. J Cell Biol, 110: 1427-1438.
11Usami S, Wang SL, Skierczynski BA, et al. Locomotion forces generated by a polymorphonuclear leukoyte. Biophys J, 1992, 63: 1663-1666.
12Cheresh D. Integrin: Structure, Function and biological properties. Adv Mol Cell Bio, 1993, 6: 225-228.
13Albelda SM, Buck CA. Integrins and other cell adhesion molecules. FASEB J, 1990, 4: 2868-2880.
14Torimura T, Ueno T, Kin M, et al. Integrin alpha 6 betal 1 plays a significant role in the attachment of hepatoma cells to laminin. J Hepatol, 1999, 31: 734-740. 

    基金项目：国家自然科学基金(39970198)和教育部重点实验室访问学者基金(校科字[2002]4号)

    作者单位：400044 重庆大学生物工程学院教育部生物力学与组织工程重点实验室（傅遍红、
    吴泽志、张海雁、秦建、蔡绍哲、吴云鹏）；美国宾夕法尼亚州州立大学生物工程系（董澄）

    傅遍红，现工作于重庆大学资源与环境科学学院。